La 25-hidroxivitamina D (25-OH-D) circulante está ampliamente reconocida como el mejor indicador del estado de la vitamina D. En la circulación sanguínea, los dos principales metabolitos de la vitamina D son la 25-OH-Vitamina D3 y la 25-OH-Vitamina D2. la 25-OH-D3 procede principalmente de la vitamina D3 producida por la luz solar en la piel, mientras que la 25-OH-D2 procede de las plantas de la dieta. En la actualidad existen dos tipos principales de métodos utilizados de forma rutinaria para medir la 25-OH-D: los métodos basados en la separación cromatográfica seguida de la detección directa no inmunológica y los inmunoensayos competitivos. La mayoría de los inmunoensayos dependen de un anticuerpo que puede detectar tanto la 25-OH Vitamina D2 como la 25-OH Vitamina D3 juntas y da resultados totales. Pero la proporción de detección de 25-OHD2 es variable.
Actualmente se dispone de dos métodos no inmunológicos para la detección directa: la cromatografía líquida de alta presión (HPLC) y la cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/ MS). Los métodos cromatográficos son capaces de medir la 25-OH-D2 y la 25-OH-D3 de forma independiente con una excelente precisión y sensibilidad.
Por otro lado, hay muchos estudios y artículos científicos que muestran la inexactitud de la medición de la vitamina D total con inmunoensayos comerciales sin separar y medir los metabolitos de la vitamina D2 y la vitamina D3 individualmente. Se recomienda que cualquier ensayo de 25-OH-D en los laboratorios clínicos mida tanto la 25-OH-D2 como la 25-OH-D3 por igual para poder informar de un valor total de 25-OH-D. Los inmunoensayos evaluados miden la 25-OH-D total (tanto la 25-OH-D3 como la 25-OH-D2), pero la reacción cruzada con la 25-OH-D2 y la 25-OH-D3 difiere del 52 al 100% en los distintos métodos.
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