Sistema de fotometría por fibra para la investigación FLiP

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Resumen
El sistema RWD de fotometría de vida media de fluorescencia (FLiP) se basa en la tecnología Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) combinada con fotometría por fibra para monitorizar en tiempo real los cambios en la vida media de fluorescencia en el cerebro de animales en libertad, proporcionando un enfoque estable y cuantitativo para estudios in vivo sobre liberación de neurotransmisores, interacciones proteína–proteína y cambios conformacionales de proteínas.

¿Qué es la vida media de fluorescencia?
La vida media de fluorescencia (τ) es el tiempo medio que un fluoróforo permanece en su estado excitado antes de emitir un fotón. A diferencia de la intensidad de fluorescencia, la vida media es independiente de la concentración del fluoróforo y de la potencia de excitación, y refleja cambios conformacionales y el microambiente local. Las mediciones de vida media permiten separar varias componentes de vida media y detectar cambios sutiles, proporcionando una lectura cuantitativa estable para experimentos in vivo.

¿Por qué la vida media de fluorescencia?

• Mediciones cuantitativas y comparables entre muestras — sin normalización al valor inicial
• Registros estables a largo plazo — adecuados para estudios de sueño, modelos de enfermedades crónicas y estudios longitudinales
• Detección sensible de cambios dinámicos en analitos mediante biosensores basados en la vida media

Dos métodos de medición principales
Dominio temporal
Excita la muestra con una fuente de luz pulsada y registra la decaimiento temporal de la fluorescencia. TCSPC mide las diferencias de tiempo entre los fotones emitidos y los pulsos de excitación para construir histogramas de decaimiento y realizar ajustes exponenciales, ofreciendo alta resolución temporal, excelente relación señal/ruido en flujos bajos de fotones y separación precisa de múltiples componentes de vida media.

Dominio de frecuencia
Utiliza una fuente continua modulada sinusoidalmente y obtiene la vida media a partir del desfase y la profundidad de modulación entre emisión y excitación. Los sistemas de dominio de frecuencia son más sencillos, permiten adquisiciones rápidas y pueden funcionar sin láseres pulsados, siendo adecuados para mediciones con alto flujo de fotones.

Comparación (Dominio temporal vs Dominio de frecuencia)

• Precisión de la medición de vida media: Dominio temporal — alta; Dominio de frecuencia — buena
• RSI para muestras de baja fluorescencia: Dominio temporal — excelente; Dominio de frecuencia — relativamente limitado
• Resolución de múltiples componentes: Dominio temporal — alta precisión; Dominio de frecuencia — requiere modulación multifrecuencia o análisis phasor
• Velocidad de adquisición: Dominio temporal — relativamente rápida; Dominio de frecuencia — rápida
• Muestras de alto flujo de fotones: Dominio temporal — buena; Dominio de frecuencia — excelente
• Requisito de láser: Dominio temporal — láser pulsado; Dominio de frecuencia — fuente continua modulada

Puntos destacados del sistema de fotometría de vida media

• Estabilidad del sistema excepcional: rendimiento consistente que minimiza las fluctuaciones del estado del dispositivo para comparaciones longitudinales fiables
• Ruido del sistema ultra-bajo: preserva la integridad de los datos incluso en condiciones de señal débil
• Registro fiable a largo plazo: componentes centrales estables que minimizan la deriva de la línea base durante semanas consecutivas
• Amplia compatibilidad de biosensores: soporta el rango de diseño de vida media de biosensores convencionales
• Análisis cuantitativo directo: función de curva estándar prevista para permitir lecturas directas de concentración

Ejemplos de aplicaciones

• Mediciones de neuromoduladores entre animales y en escalas temporales crónicas: FLiP permite comparaciones basadas en la vida media entre animales y durante semanas para sensores como GRAB ACh3.0
• Estudios mecanísticos en modelos genéticos: utilizado para revelar dinámicas anormales de la actividad de PKA en ratones mutantes Akap11 y las respuestas farmacológicas relacionadas
• Validación de nuevos sensores: validación del sensor de calcio de vida media de alta velocidad (LifeCamp) para mediciones absolutas de línea base y transitorias de calcio en ratones en libertad

Especificaciones técnicas

• Longitudes de onda de excitación: 488, 515, 560, 640, 670 nm (personalizable)
• Frecuencia de pulso: 1–80 MHz
• Rango de medición de vida media: 1–10 ns
• Tasa de muestreo: 1–50 Hz
• Conteo DIO: 8
• Nivel de tensión: 3,3–5 V
• Diámetro del núcleo de la fibra óptica: 200 o 400 µm
• Apertura numérica (NA): 0,37