Sistema de fotometría por fibra para la investigación FLiP

neurocienciasfibra ópticade fluorescencia

Resumen
El RWD Fluorescence Lifetime Photometry System (FLiP) combina Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) con fotometría por fibra para monitorizar en tiempo real los cambios en la vida media de fluorescencia en el cerebro de animales en libertad. FLiP permite medidas in vivo estables y cuantitativas de la dinámica de neurotransmisores, interacciones proteína–proteína y cambios conformacionales, informando la vida media de fluorescencia (τ), un parámetro intrínseco mayormente independiente del nivel de expresión del sensor, fotoblanqueo y artefactos de movimiento.

¿Por qué la vida media de fluorescencia?

• La vida media es independiente de la concentración del fluoróforo y de la potencia de excitación, y refleja el microambiente local y cambios conformacionales.
• Proporciona lecturas cuantitativas comparables entre muestras sin necesidad de normalizar a una línea base.
• Adecuada para registros estables a largo plazo en estudios de sueño, modelos de enfermedades crónicas y estudios longitudinales.
• Permite la detección sensible de cambios dinámicos de analitos mediante biosensores basados en la vida media.

Dos métodos de medida habituales

• Dominio temporal (TCSPC): Excita la muestra con luz pulsada y registra la decadencia temporal de la fluorescencia. TCSPC cronometra fotones individuales para construir histogramas de decadencia y extraer vidas medias mediante ajuste exponencial. Ofrece alta resolución temporal y mejor SNR a flujos de fotones bajos; puede resolver múltiples componentes de vida media con alta precisión.
• Dominio frecuencial: Excita con luz continua modulada sinusoidalmente y deriva la vida media a partir del retraso de fase y la profundidad de modulación. Implementación más simple y adquisición rápida, adecuada para muestras con alto flujo de fotones o sistemas sin láser pulsado.

Comparación (Dominio temporal vs Dominio frecuencial)

• Precisión en la medición de la vida media — Dominio temporal (TCSPC): alta; Dominio frecuencial: buena
• SNR en muestras débilmente fluorescentes — Dominio temporal (TCSPC): excelente; Dominio frecuencial: relativamente limitado
• Resolución de múltiples componentes de vida media — Dominio temporal (TCSPC): alta precisión; Dominio frecuencial: requiere modulación multifrecuencia o análisis phasor
• Velocidad de adquisición — Dominio temporal (TCSPC): relativamente rápida; Dominio frecuencial: rápida
• Muestras con alto flujo de fotones — Dominio temporal (TCSPC): bueno; Dominio frecuencial: excelente
• Requisito de láser — Dominio temporal (TCSPC): láser pulsado; Dominio frecuencial: fuente continua modulada

Puntos clave del sistema FLiP

• Estabilidad del sistema diseñada para minimizar fluctuaciones del estado del dispositivo y permitir comparaciones longitudinales fiables.
• Bajo ruido del sistema para preservar la integridad de la señal en niveles de fluorescencia débiles.
• Capacidad para registros a largo plazo con deriva de línea base minimizada durante semanas consecutivas.
• Compatibilidad con una amplia gama de biosensores de vida media.
• Análisis cuantitativo directo: funcionalidad de curva estándar prevista para convertir lecturas de vida media en estimaciones de concentración.

Ejemplos de aplicación

• Mediciones de neuromoduladores a escala crónica e interanimales: lecturas de vida media (p. ej. GRAB ACh3.0) permanecen estables pese a variaciones en potencia láser y expresión, y permiten distinguir estados conductuales.
• Estudios mecanísticos de genes de riesgo psiquiátrico: FLiP empleado para revelar dinámicas anormales de PKA estriatal en ratones mutantes Akap11 en registros de animales en libertad.
• Desarrollo y validación de nuevos sensores de vida media: p. ej. LifeCamp, sensor de vida media de calcio que permite la medición absoluta de señales de calcio transitorias y basales entre tipos celulares y comportamientos.

Características / especificaciones técnicas

• Especificaciones generales del sistema
  • Opciones de longitud de onda de excitación: 488, 515, 560, 640, 670 nm (personalizable)
  • Frecuencia de pulso: 1–80 MHz
  • Rango de medida de vida media: 1–10 ns
  • Tasa de muestreo: 1–50 Hz
  • Cuenta DIO: 8
  • Nivel de voltaje: 3.3–5 V
  • Diámetro del núcleo de fibra óptica: 200 o 400 µm
  • Apertura numérica (NA): 0.37
• Compatibilidad con biosensores de vida media (ejemplos con longitudes de excitación)
  • Ca2+: Tq–Ca–FLITS — excitación ~439 nm; tr-CCaMP — ~437 nm; tr-GCaMP — ~493 nm; tr-RCaMP — ~563 nm; RCaMP1h — ~560 nm; LifeCaMP — ~488 nm
  • ACh (acetilcolina): GRAB ACh3.0 — 488 nm; variantes GRAB FLIM-ACh — 515 nm; GRAB WHalo-ACh-1.0 (basado en colorante) — 565 nm / 680 nm (dyes JF)
  • DA (dopamina): dLight3.8 — 488 nm; GRAB FLIM-DA1.0 — 515 nm
  • PKA: tAKARα, tAKARβ, tAKARγ — 488 nm; FLIM-AKAR — 488 nm; GRAB FLIM-PKA — 515 nm
  • PKC: CKAR3 — 488 nm
  • Glutamato extracelular: Rncp-iGluSnFR1 — 560 nm
  • Serotonina (5-HT): sDarken — 488 nm
  • Norepinefrina (NE): GRAB FLIM-NE1h / GRAB FLIM-NE1m — 515 nm; GRAB rNE3.0 — 560 nm; GRAB TMP-NE1.0 (basado en colorante) — ~690 nm; GRAB WHalo-NE — 565 nm / 680 nm (dyes JF)
  • 5-HT (variante): GRAB FLIM-5-HT0.3 — 515 nm
  • CRF: GRAB rCRF1.0 — 570 nm
  • PACAP: GRAB rPACAP1.0 — 570 nm
  • Glucosa: iGlucoSnFR-TS — 400 nm
  • Lactato: LiLac — 425 nm
  • ATP: qMaLioffG — 488 nm