La ADN ligasa T4 cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre el 5'-fosfato y el 3'-hidroxilo adyacentes en el extremo romo o cohesivo del dsADN. También puede catalizar el enlace de ARN con ssADN o ARN en ácidos nucleicos bicatenarios. Sin embargo, no puede catalizar enlaces entre nucleótidos monocatenarios. La ligasa de ADN T4 puede utilizarse para marcar el extremo 3' del ARN, ciclizar oligonucleótidos de ARN y ADN, clonar ADNc y otras manipulaciones de ácidos nucleicos.
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